雄性特異性途徑在溫度依賴性性別決定中的轉錄調控
脊椎動物的性別決定系統(tǒng)主要分為基因型性別決定（GSD）和環(huán)境性別決定（ESD）。環(huán)境性別決定中最突出的形式是溫度依賴性性別決定（TSD），在這種情況下，胚胎發(fā)育關鍵階段（即溫度敏感期，TSP）的孵化溫度決定了后代的性別。近期，有客戶使用多個云克隆ELISA試劑盒（CEA911Ge/CEA540Ge/CEA462Ge/CEA458Ge/CEA443Ge/CEA461Ge）在《Science Bulletin》上發(fā)表的相關研究闡明了紅耳龜雄性決定途徑的調控模式。研究表明紅耳龜的溫敏類固醇生成細胞（TSSCs）中Ca2+誘導的醛固酮分泌在TSP期間對雄性性別決定起著關鍵作用；位于前支持細胞中的NR3C1（雄性決定途徑的主要調節(jié)因子）作為醛固酮受體，對于上調DMRT1（雄性性別決定基因）表達和協調雄性性別決定至關重要。
圖1. 龜類溫度依賴性雄性性別決定轉錄調控模式圖
（圖片源自《Science Bulletin》）
研究者首先從紅耳龜在雌性產生溫度（FPT，32℃）和雄性產生溫度（MPT，26℃）下孵化的個體中分離出胚胎性腺，并將性腺分化期定義為不同的階段（第16~20階段）。隨后在不同階段采集發(fā)育中的性腺，通過單細胞測序研究其分子和細胞過程。作者發(fā)現，到胚胎起始階段（第15階段），龜的生殖腺已經包含了單細胞測序鑒定出的所有細胞類型。這表明溫度依賴性性別決定機制在生殖腺系統(tǒng)高度分化狀態(tài)下起作用，這依賴于先前存在的細胞群的進一步特化和重排。
作者發(fā)現在單細胞分辨率下，TSSCs主要表達的蛋白種類和其他類型細胞不同，主要是KCNK3、CaV3.2和CaV1.2。從第15階段到第19階段TSSCs數量的下降和TSP的持續(xù)時間一致，表明TSSCs在溫度敏感期起關鍵作用。此外，基因富集分析（KEGG）和基因本體論（GO）分析結果表明類固醇生成活性是TSSCs的關鍵功能。
圖2. 胚胎性腺單細胞轉錄組分析
（圖片源自《Science Bulletin》）
為了探究細胞內鈣離子信號是否調節(jié)TSSCs中的醛固酮生成，作者在細胞水平上對KCNK3和CaV通道進行了藥理學干預。結果顯示，將培養(yǎng)溫度從32℃降至26℃特異性地增加了TSSCs中的醛固酮合成，且醛固酮在性腺中呈分泌高峰，而其他類固醇激素則無此現象。阻斷KCNK3導致TSSCs產生鈣離子內流，且使用選擇性醛固酮合成酶抑制劑BI-689648能夠有效降低醛固酮水平。表明性腺支持細胞數量的減少可能是導致醛固酮生成存在溫度敏感窗口的原因。
圖3. TSSCs和性腺中的類固醇生成
（圖片源自《Science Bulletin》）
接著，作者就醛固酮的生成發(fā)生和雄性性別決定溫度之間的關系進行了研究。鑒于在28℃時兩性均可發(fā)育，作者研究了醛固酮注射是否能促進雄性分化。結果表明，醛固酮的應用顯著提高了雄性個體的產量，使性別比例從平衡狀態(tài)轉變?yōu)樾坌詾橹?。?6℃的全雄性溫度下，用BI-689648使雌性比例顯著上升。而在32℃醛固酮的應用不能誘導雌性向雄性轉變。這些結果支持了由溫度-鈣離子信號系統(tǒng)調節(jié)的TSSCs衍生的醛固酮是雄性性別決定途徑中的主要決定因素。
圖4. 醛固酮產生增強雄性性別決定
（圖片源自《Science Bulletin》）
隨后，作者探究了醛固酮在調節(jié)支持細胞特化中的作用。通過細胞譜系軌跡分析發(fā)現醛固酮對海龜NR3C1的核轉位、DNA結合以及轉錄調控至關重要。在龜類中NR3C1對醛固酮結合以及雄性發(fā)育途徑中具有重要作用。利用醛固酮受體拮抗劑螺內酯可使NR3C1對DMRT1基因的調節(jié)作用降低約70%。此外，NR3C1還能增強ATF1和DMRT1對DMRT1基因的轉錄激活作用。表明NR3C1、ATF1和DMRT1在DMRT1基因表達中存在協同效應。
為了闡明體內NR3C1的轉錄調控機制，作者使用螺內酯來探究在全雄性發(fā)育溫度下通過抑制NR3C1對雄性發(fā)育的影響。26℃下螺內酯處理的141個胚胎中，87個生殖腺呈類雌性形態(tài)（皮質增厚、髓索退化），其生殖細胞標記物（VASA）和支持細胞標記物（SOX9）陽性細胞的分布也與雌性類似。這些發(fā)現表明破壞NR3C1會在全雄性溫度下誘導雌性發(fā)育，凸顯醛固酮結合的NR3C1對雄性發(fā)育途徑調節(jié)的關鍵作用。
圖5. 醛固酮結合NR3C1觸發(fā)DMRT1表達以確定雄性性別分化
（圖片源自《Science Bulletin》）
總之，本研究發(fā)現了溫度啟動TSD物種雄性性別決定的全新雄性特異性途徑。為理解龜類雄性決定的分子細胞基礎及探索不同進化背景下的TSD模式奠定了基礎。
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