實(shí)驗(yàn)原理 

肽-N-糖苷酶F（PNGase F），可以在N-連接糖蛋白的高甘露糖、雜合和復(fù)合寡糖部分最內(nèi)側(cè)的N-乙酰葡萄糖胺和天冬酰胺殘基之間進(jìn)行切割。本試驗(yàn)以真核表達(dá)的重組Interferon Gamma（IFNg）蛋白為底物來(lái)測(cè)定重組肽-N-糖苷酶F的活性。

實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

     試劑：10×變性緩沖液：5% SDS，400mM DTT

           反應(yīng)緩沖液：50mmol/L Tris (pH7.4)，150mM NaCl，1% NP-40

     儀器：SDS-PAGE電泳儀

實(shí)驗(yàn)步驟 

將真核蛋白Interferon Gamma （IFNg）用1×變性緩沖液稀釋成1μg/μL，在100℃煮沸10min使其變性。將重組蛋白PNGase F用反應(yīng)緩沖液從1000ng/mL開(kāi)始進(jìn)行兩倍稀釋?zhuān)總€(gè)濃度取10μL，再加入10μL變性IFNg蛋白在37℃下反應(yīng)1h，最后在100℃煮沸5min終止反應(yīng)，用SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果及計(jì)算

酶活定義：

在10μL反應(yīng)體系中，37℃條件下，1小時(shí)從10μg變性IFNg中去除超過(guò)95%的碳水化合物所需的酶量定義為一個(gè)單位。

Figure 1. The deglycosylation of IFNg detect by SDS-PAGE

結(jié)果顯示，37℃條件下，1小時(shí)從10μg變性IFNg中去除超過(guò)95%的碳水化合物所需的PNGase F為2.5ng。

參考信息

云克隆貨號(hào)：APX267Ge01