細(xì)胞transwell 遷移侵襲實驗方案

一、實驗?zāi)康模?/span> 

主要用于趨化因子家族或者某些補(bǔ)體以及某些具有趨化活性的蛋白活性檢測。

二、實驗儀器：

倒置顯微鏡 酶標(biāo)儀 超凈工作臺 CO₂培養(yǎng)箱

三、相關(guān)試劑、耗材：

24孔transwell小室  胎牛血清  DMEM/1640培養(yǎng)基 結(jié)晶紫 基質(zhì)膠

四、實驗步驟：

A. 細(xì)胞遷移  

1 . 將細(xì)胞消化，終止后離心棄去培養(yǎng)液，用 PBS 洗 1-2 遍，用無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至 1~5×10⁵左右，每孔100-200μl加入小室上室中。

2. 下室加入用無血清培養(yǎng)基按5-10倍梯度稀釋的待檢測蛋白，每孔500μl。對于貼壁細(xì)胞，下室可加入含1-2% FBS低血清培養(yǎng)基。

3. 陽性對照孔的設(shè)置，下室加入10% FBS的培養(yǎng)基；陰性對照孔設(shè)置為下室加入不含待測蛋白不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)基。

4.將transwell板放入5% CO₂ ，37℃培養(yǎng)箱中，60-90min后觀察結(jié)果。

B. 細(xì)胞侵襲  

1. 包被基質(zhì)膠，根據(jù)說明書上推薦的濃度進(jìn)行稀釋包被transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風(fēng)干。

2. 其它步驟同細(xì)胞遷移一樣，觀察實驗結(jié)果前需用棉簽擦掉transwell小室上的基質(zhì)膠

檢測方法：

1. 懸浮細(xì)胞穿過膜后會直接掉入下室，移除上室，用倒置顯微鏡觀察可直接計數(shù)，在高倍鏡下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行計數(shù)，最后計算平均值。或者收集下室培養(yǎng)液，用流式細(xì)胞儀計數(shù)。        

2. 貼壁細(xì)胞的計數(shù)：將上室培養(yǎng)液吸出，棄掉，等膜風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫染色，把Transwell小室反過來底朝上用正置顯微鏡觀察在高倍鏡下隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行計數(shù)或者用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570 nm 測其OD值，間接反映細(xì)胞數(shù)。

注意事項：

1. 根據(jù)趨化實驗的靶細(xì)胞選擇合適的趨化濾膜的孔徑，中性粒細(xì)胞用3μm孔徑的PVPF聚碳酸膜（ Polycarbonate membranes），單核細(xì)胞用8μm孔徑的PVPF聚碳酸膜，淋巴細(xì)胞則用5-8μm孔徑的PVPF。

2. 趨化時間，通常中性粒細(xì)胞趨化時間為30分鐘，單核細(xì)胞趨化時間為90分鐘，淋巴細(xì)胞趨化時間為180分鐘。具體趨化時間需要參考文獻(xiàn)或者根據(jù)實際實驗情況而定，貼壁細(xì)胞通常要24小時以上。

3. 趨化因子濃度的確定： 由于趨化因子的特異活性非常高，某些趨化因子在較高濃度時促進(jìn)細(xì)胞趨化的作用反而降低，所以待測樣品常需連續(xù)稀釋（5倍或10倍系列稀釋）以獲得最適劑量的趨化結(jié)果。每次實驗都需設(shè)好對照，因為不同來源或不同活力靶細(xì)胞的趨化能力差異很大。趨化因子活性的表達(dá)方式有三種，其中最常用的是用趨化指數(shù)表示，趨化指數(shù)（chemotactic index,CI）是指細(xì)胞遷移到待測樣品液的數(shù)目和遷移到對照液的數(shù)目的比值。

4. 細(xì)胞侵襲常用8.0、12.0μm膜，有侵襲能力的細(xì)胞才可用于 Transwell 侵襲實驗，侵襲實驗前最好先檢測細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)情況。